各位小伙伴有沒(méi)有遇到過(guò)這樣的情況：

明明嚴(yán)格按照步驟來(lái)，結(jié)果卻總是差那么一點(diǎn)？

洗滌步驟到底要做到什么程度才算合格？

溫育時(shí)間稍微有點(diǎn)偏差會(huì)不會(huì)影響結(jié)果？

顯色反應(yīng)的終止時(shí)機(jī)，到底怎么判斷才最準(zhǔn)確？

今天咱們就來(lái)好好嘮嘮那些 ELISA 實(shí)驗(yàn)里容易被忽略卻又至關(guān)重要的操作要點(diǎn)，看看能不能解決大家的這些 “小煩惱”。

血清樣本、抗原和抗體都需要稀釋，稀釋的準(zhǔn)確性關(guān)系到檢測(cè)的精確性。注意所用的移液器、吸頭和容器一致。稀釋完成后保證混合均勻。

加樣時(shí)要加在板孔底部，避免加在孔壁和濺出，不能產(chǎn)生氣泡。加入不同的物質(zhì)時(shí)要更換吸頭，避免交叉污染。在加顯色液時(shí)，最好使用多道移液器，使加樣時(shí)間盡量統(tǒng)一，減小結(jié)果誤差。

洗滌主要目的是去除殘留的未與固相載體上的抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)、游離的酶標(biāo)記物、以及在反應(yīng)過(guò)程中非特異性地吸附于固相載體上的干擾物質(zhì)等。如果洗滌不完全，可能會(huì)導(dǎo)致背景吸光度值偏高，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

洗滌次數(shù) ：通常情況下，洗滌次數(shù)應(yīng)不少于 3 次，部分實(shí)驗(yàn)要求洗滌 6 次或更多，以確保盡可能去除未結(jié)合的物質(zhì)。

洗滌時(shí)間 ：洗滌過(guò)程中，洗液在孔中的停留時(shí)間也很重要，一般可選擇 1 - 5 分鐘的靜止時(shí)間，讓洗液充分作用，使各個(gè)孔的結(jié)合和洗滌情況趨于一致。

洗滌液量 ：洗滌液的量要足夠，一般建議洗滌量使用 300 μl 及以上，且所有孔中的洗滌體積必須相等，以保證洗滌效果。

洗滌后殘留 ：洗滌后，孔內(nèi)不應(yīng)有明顯的殘留液體或雜質(zhì)，可通過(guò)觀察孔內(nèi)是否清澈、無(wú)殘留物來(lái)初步判斷。

孵育溫度：不同品牌的試劑盒孵育溫度不同，一般為37℃、室溫或4℃。

孵育時(shí)間：孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能會(huì)導(dǎo)致非特異性吸附，過(guò)短可能導(dǎo)致抗體與抗原的結(jié)合不充分，一般孵育1-1.5h。

孵育環(huán)境：孵育過(guò)程中，環(huán)境濕度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也有一定影響。如果濕度較低，可能會(huì)導(dǎo)致孔板中的液體蒸發(fā)，影響孵育體積和濃度，進(jìn)而影響檢測(cè)結(jié)果孵育；對(duì)于一些使用碳酸鹽緩沖液的 ELISA 實(shí)驗(yàn)，二氧化碳濃度也會(huì)影響孵育效果。二氧化碳可以與水反應(yīng)生成碳酸，進(jìn)而影響緩沖液的 pH 值。

所以孵育操作請(qǐng)嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

顯色是ELISA中的最后一步反應(yīng)，酶催化底物產(chǎn)生顯色反應(yīng)。反應(yīng)溫度和時(shí)間是影響顯色的關(guān)鍵因素。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色，一般情況下，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品的高濃度孔（如 S1 孔）出現(xiàn)明顯的顏色反應(yīng)，如淡藍(lán)色，而低濃度孔（如 S5 孔）也有淡淡的藍(lán)色，同時(shí)空白孔（Blank 孔）無(wú)明顯藍(lán)色時(shí)，即可認(rèn)為顯色達(dá)到一定程度，可以終止反應(yīng)。

產(chǎn)品介紹